Η υγρή χρωματογραφία είναι η κύρια μέθοδος για τον έλεγχο της περιεκτικότητας κάθε συστατικού και των ακαθαρσιών σε πρώτες ύλες, ενδιάμεσα, παρασκευάσματα και υλικά συσκευασίας, αλλά πολλές ουσίες δεν έχουν τυποποιημένες μεθόδους στις οποίες να βασίζονται, επομένως είναι αναπόφευκτη η ανάπτυξη νέων μεθόδων. Στην ανάπτυξη μεθόδων υγρής φάσης, η χρωματογραφική στήλη είναι ο πυρήνας της υγρής χρωματογραφίας, επομένως ο τρόπος επιλογής μιας κατάλληλης χρωματογραφικής στήλης είναι ζωτικής σημασίας. Σε αυτό το άρθρο, ο συγγραφέας θα εξηγήσει πώς να επιλέξετε μια στήλη υγρής χρωματογραφίας από τρεις πτυχές: γενικές ιδέες, σκέψεις και πεδίο εφαρμογής.
Α. Συνολικές ιδέες για την επιλογή στηλών υγρής χρωματογραφίας
1. Αξιολογήστε τις φυσικές και χημικές ιδιότητες της αναλυόμενης ουσίας: όπως η χημική δομή, η διαλυτότητα, η σταθερότητα (όπως εάν είναι εύκολο να οξειδωθεί/ανάγεται/υδρολυθεί), οξύτητα και αλκαλικότητα κ.λπ., ειδικά η χημική δομή είναι το κλειδί παράγοντας στον προσδιορισμό των ιδιοτήτων, όπως η συζευγμένη ομάδα έχει ισχυρή απορρόφηση υπεριώδους και ισχυρό φθορισμό.
2. Προσδιορίστε τον σκοπό της ανάλυσης: εάν απαιτείται υψηλός διαχωρισμός, υψηλή απόδοση στήλης, σύντομος χρόνος ανάλυσης, υψηλή ευαισθησία, αντίσταση υψηλής πίεσης, μεγάλη διάρκεια ζωής στήλης, χαμηλό κόστος κ.λπ.
- Επιλέξτε μια κατάλληλη χρωματογραφική στήλη: κατανοήστε τη σύνθεση, τις φυσικές και χημικές ιδιότητες του χρωματογραφικού πληρωτικού, όπως το μέγεθος των σωματιδίων, το μέγεθος των πόρων, την ανοχή στη θερμοκρασία, την ανοχή του pH, την προσρόφηση της αναλυόμενης ουσίας κ.λπ.
- Θεωρήσεις για την επιλογή στηλών υγρής χρωματογραφίας
Αυτό το κεφάλαιο θα συζητήσει τους παράγοντες που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή μιας στήλης χρωματογραφίας από την προοπτική των φυσικών και χημικών ιδιοτήτων της ίδιας της στήλης χρωματογραφίας. 2.1 Πίνακας πλήρωσης
2.1.1 Μήτρα πυριτικής πηκτής Η μήτρα πλήρωσης των περισσότερων στηλών υγρής χρωματογραφίας είναι πυριτική γέλη. Αυτός ο τύπος πληρωτικού έχει υψηλή καθαρότητα, χαμηλό κόστος, υψηλή μηχανική αντοχή και είναι εύκολο να τροποποιήσει ομάδες (όπως δεσμούς φαινυλίου, δεσμούς αμινοξέων, δεσμούς κυανό κ.λπ.), αλλά η τιμή pH και το εύρος θερμοκρασίας που ανέχεται είναι περιορισμένα: Το εύρος pH των περισσότερων πληρωτικών μήτρας πυριτικής πηκτής είναι 2 έως 8, αλλά το εύρος pH των ειδικά τροποποιημένων φάσεων που συνδέονται με πυριτική πηκτή μπορεί να είναι τόσο ευρεία όσο 1,5 έως 10, ενώ υπάρχουν επίσης ειδικά τροποποιημένες φάσεις δεσμευμένες με πυριτική γέλη που είναι σταθερές σε χαμηλό pH. όπως το Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, το οποίο είναι σταθερό σε pH 1 έως 8. το ανώτερο όριο θερμοκρασίας της μήτρας πυριτικής πηκτής είναι συνήθως 60 ℃ και ορισμένες στήλες χρωματογραφίας μπορούν να ανεχθούν θερμοκρασία 40 ℃ σε υψηλό pH.
2.1.2 Πολυμερής μήτρα Τα πολυμερή πληρωτικά είναι κυρίως πολυστυρόλιο-διβινυλοβενζόλιο ή πολυμεθακρυλικό. Τα πλεονεκτήματά τους είναι ότι μπορούν να ανεχθούν ένα ευρύ φάσμα pH - μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην περιοχή από 1 έως 14 και είναι πιο ανθεκτικά σε υψηλές θερμοκρασίες (μπορεί να φτάσουν πάνω από 80 °C). Σε σύγκριση με τα πληρωτικά C18 με βάση το πυρίτιο, αυτός ο τύπος πληρωτικού έχει ισχυρότερη υδροφοβικότητα και το μακροπορώδες πολυμερές είναι πολύ αποτελεσματικό στον διαχωρισμό δειγμάτων όπως οι πρωτεΐνες. Τα μειονεκτήματά του είναι ότι η απόδοση της στήλης είναι χαμηλότερη και η μηχανική αντοχή είναι ασθενέστερη από αυτή των πληρωτικών με βάση το πυρίτιο. 2.2 Σχήμα σωματιδίων
Τα περισσότερα σύγχρονα πληρωτικά HPLC είναι σφαιρικά σωματίδια, αλλά μερικές φορές είναι ακανόνιστα σωματίδια. Τα σφαιρικά σωματίδια μπορούν να παρέχουν χαμηλότερη πίεση στήλης, υψηλότερη απόδοση στήλης, σταθερότητα και μεγαλύτερη διάρκεια ζωής. όταν χρησιμοποιούνται κινητές φάσεις υψηλού ιξώδους (όπως το φωσφορικό οξύ) ή όταν το διάλυμα του δείγματος είναι παχύρρευστο, τα ακανόνιστα σωματίδια έχουν μεγαλύτερη ειδική επιφάνεια, η οποία είναι πιο ευνοϊκή για την πλήρη δράση των δύο φάσεων και η τιμή είναι σχετικά χαμηλή. 2.3 Μέγεθος σωματιδίων
Όσο μικρότερο είναι το μέγεθος των σωματιδίων, τόσο μεγαλύτερη είναι η απόδοση της στήλης και τόσο μεγαλύτερος ο διαχωρισμός, αλλά τόσο χειρότερη είναι η αντίσταση σε υψηλή πίεση. Η στήλη που χρησιμοποιείται πιο συχνά είναι η στήλη μεγέθους σωματιδίων 5 μm. Εάν η απαίτηση διαχωρισμού είναι υψηλή, μπορεί να επιλεγεί ένα πληρωτικό 1,5-3 μm, το οποίο συμβάλλει στην επίλυση του προβλήματος διαχωρισμού ορισμένων σύνθετων δειγμάτων μήτρας και πολλαπλών συστατικών. Το UPLC μπορεί να χρησιμοποιήσει πληρωτικά 1,5 μm. Συχνά χρησιμοποιούνται πληρωτικά μεγέθους σωματιδίων 10 μm ή μεγαλύτερου για ημιπροπαρασκευαστικές ή προπαρασκευαστικές στήλες. 2.4 Περιεκτικότητα σε άνθρακα
Η περιεκτικότητα σε άνθρακα αναφέρεται στην αναλογία της δεσμευμένης φάσης στην επιφάνεια της γέλης πυριτίου, η οποία σχετίζεται με την ειδική επιφάνεια και την κάλυψη της συνδεδεμένης φάσης. Η υψηλή περιεκτικότητα σε άνθρακα παρέχει υψηλή χωρητικότητα στήλης και υψηλή ανάλυση και χρησιμοποιείται συχνά για σύνθετα δείγματα που απαιτούν υψηλό διαχωρισμό, αλλά λόγω του μεγάλου χρόνου αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο φάσεων, ο χρόνος ανάλυσης είναι μεγάλος. Οι χρωματογραφικές στήλες χαμηλής περιεκτικότητας σε άνθρακα έχουν μικρότερο χρόνο ανάλυσης και μπορούν να εμφανίσουν διαφορετικές επιλεκτικότητες και χρησιμοποιούνται συχνά για απλά δείγματα που απαιτούν ταχεία ανάλυση και δείγματα που απαιτούν συνθήκες υψηλής υδατικής φάσης. Γενικά, η περιεκτικότητα σε άνθρακα του C18 κυμαίνεται από 7% έως 19%. 2.5 Μέγεθος πόρων και ειδική επιφάνεια
Τα μέσα προσρόφησης HPLC είναι πορώδη σωματίδια και οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις λαμβάνουν χώρα στους πόρους. Επομένως, τα μόρια πρέπει να εισέλθουν στους πόρους για να προσροφηθούν και να διαχωριστούν.
Το μέγεθος των πόρων και η ειδική επιφάνεια είναι δύο συμπληρωματικές έννοιες. Μικρό μέγεθος πόρων σημαίνει μεγάλη ειδική επιφάνεια και το αντίστροφο. Μια μεγάλη ειδική επιφάνεια μπορεί να αυξήσει την αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων του δείγματος και των συνδεδεμένων φάσεων, να ενισχύσει τη συγκράτηση, να αυξήσει τη φόρτωση του δείγματος και τη χωρητικότητα της στήλης και τον διαχωρισμό των σύνθετων συστατικών. Τα πλήρως πορώδη πληρωτικά ανήκουν σε αυτόν τον τύπο πληρωτικών. Για όσους έχουν υψηλές απαιτήσεις διαχωρισμού, συνιστάται η επιλογή πληρωτικών με μεγάλη ειδική επιφάνεια. Η μικρή ειδική επιφάνεια μπορεί να μειώσει την αντίθλιψη, να βελτιώσει την απόδοση της στήλης και να μειώσει τον χρόνο ισορροπίας, ο οποίος είναι κατάλληλος για ανάλυση κλίσης. Τα πληρωτικά με κέλυφος πυρήνα ανήκουν σε αυτόν τον τύπο πληρωτικών. Προκειμένου να διασφαλιστεί ο διαχωρισμός, συνιστάται η επιλογή πληρωτικών με μικρή ειδική επιφάνεια για όσους έχουν υψηλές απαιτήσεις απόδοσης ανάλυσης. 2.6 Όγκος πόρων και μηχανική αντοχή
Ο όγκος πόρων, γνωστός και ως "όγκος πόρων", αναφέρεται στο μέγεθος του κενού όγκου ανά μονάδα σωματιδίου. Μπορεί να αντικατοπτρίζει καλά τη μηχανική αντοχή του πληρωτικού. Η μηχανική αντοχή των πληρωτικών με μεγάλο όγκο πόρων είναι ελαφρώς ασθενέστερη από αυτή των πληρωτικών με μικρό όγκο πόρων. Τα πληρωτικά με όγκο πόρων μικρότερο ή ίσο με 1,5 mL/g χρησιμοποιούνται κυρίως για διαχωρισμό HPLC, ενώ πληρωτικά με όγκο πόρου μεγαλύτερο από 1,5 mL/g χρησιμοποιούνται κυρίως για χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού και χρωματογραφία χαμηλής πίεσης. 2.7 Ποσοστό ανώτατου ορίου
Το κάλυμμα μπορεί να μειώσει τις κορυφές ουράς που προκαλούνται από την αλληλεπίδραση μεταξύ ενώσεων και εκτεθειμένων ομάδων σιλανόλης (όπως ιοντικοί δεσμοί μεταξύ αλκαλικών ενώσεων και ομάδων σιλανόλης, δυνάμεις van der Waals και δεσμοί υδρογόνου μεταξύ όξινων ενώσεων και ομάδων σιλανόλης), βελτιώνοντας έτσι την απόδοση της στήλης και το σχήμα κορυφής . Οι μη καλυμμένες δεσμευμένες φάσεις θα παράγουν διαφορετικές επιλεκτικότητες σε σχέση με τις καλυμμένες δεσμευμένες φάσεις, ειδικά για πολικά δείγματα.
- Πεδίο εφαρμογής διαφορετικών στηλών υγρής χρωματογραφίας
Αυτό το κεφάλαιο θα περιγράψει το πεδίο εφαρμογής διαφορετικών τύπων στηλών υγρής χρωματογραφίας μέσω ορισμένων περιπτώσεων.
3.1 Χρωματογραφική στήλη C18 ανάστροφης φάσης
Η στήλη C18 είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στήλη αντίστροφης φάσης, η οποία μπορεί να ανταποκριθεί στις δοκιμές περιεκτικότητας και ακαθαρσίας των περισσότερων οργανικών ουσιών και εφαρμόζεται σε ουσίες μεσαίας πολικής, ασθενώς πολικές και μη πολικές. Ο τύπος και οι προδιαγραφές της χρωματογραφικής στήλης C18 θα πρέπει να επιλέγονται σύμφωνα με τις ειδικές απαιτήσεις διαχωρισμού. Για παράδειγμα, για ουσίες με υψηλές απαιτήσεις διαχωρισμού, χρησιμοποιούνται συχνά προδιαγραφές 5 μm*4,6 mm*250 mm. για ουσίες με σύνθετες μήτρες διαχωρισμού και παρόμοια πολικότητα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν προδιαγραφές 4 μm*4,6 mm*250 mm ή μικρότερα μεγέθη σωματιδίων. Για παράδειγμα, ο συγγραφέας χρησιμοποίησε μια στήλη 3 μm*4,6 mm*250 mm για να ανιχνεύσει δύο γονοτοξικές ακαθαρσίες στο celecoxib API. Ο διαχωρισμός των δύο ουσιών μπορεί να φτάσει το 2,9, που είναι εξαιρετικό. Επιπλέον, υπό την προϋπόθεση της εξασφάλισης διαχωρισμού, εάν απαιτείται ταχεία ανάλυση, επιλέγεται συχνά μια κοντή στήλη 10 mm ή 15 mm. Για παράδειγμα, όταν ο συγγραφέας χρησιμοποίησε LC-MS/MS για να ανιχνεύσει μια γονοτοξική ακαθαρσία στο API φωσφορικής πιπερακίνης, χρησιμοποιήθηκε στήλη 3 μm*2,1 mm*100 mm. Ο διαχωρισμός μεταξύ της ακαθαρσίας και του κύριου συστατικού ήταν 2,0 και η ανίχνευση ενός δείγματος μπορεί να ολοκληρωθεί σε 5 λεπτά. 3.2 Στήλη φαινυλίου αντίστροφης φάσης
Η στήλη φαινυλίου είναι επίσης ένας τύπος στήλης αντίστροφης φάσης. Αυτός ο τύπος στήλης έχει ισχυρή επιλεκτικότητα για αρωματικές ενώσεις. Εάν η απόκριση των αρωματικών ενώσεων που μετράται από τη συνηθισμένη στήλη C18 είναι ασθενής, μπορείτε να εξετάσετε το ενδεχόμενο αντικατάστασης της στήλης φαινυλίου. Για παράδειγμα, όταν έφτιαχνα το celecoxib API, η απόκριση του κύριου συστατικού που μετρήθηκε από τη στήλη φαινυλίου του ίδιου κατασκευαστή και τις ίδιες προδιαγραφές (όλα 5 μm*4,6 mm*250 mm) ήταν περίπου 7 φορές μεγαλύτερη από αυτή της στήλης C18. 3.3 Στήλη κανονικής φάσης
Ως αποτελεσματικό συμπλήρωμα στη στήλη αντίστροφης φάσης, η στήλη κανονικής φάσης είναι κατάλληλη για εξαιρετικά πολικές ενώσεις. Εάν η κορυφή είναι ακόμα πολύ γρήγορη κατά την έκλουση με περισσότερο από 90% υδατική φάση στη στήλη αντίστροφης φάσης και ακόμη και κοντά στην κορυφή του διαλύτη και επικαλύπτεται με αυτήν, μπορείτε να εξετάσετε το ενδεχόμενο αντικατάστασης της στήλης κανονικής φάσης. Αυτός ο τύπος στήλης περιλαμβάνει λοφώδη στήλη, άμινο στήλη, στήλη κυανό κ.λπ.
3.3.1 Στήλη Hilic Η στήλη Hilic συνήθως ενσωματώνει υδρόφιλες ομάδες στη συνδεδεμένη αλκυλική αλυσίδα για να ενισχύσει την απόκριση σε πολικές ουσίες. Αυτός ο τύπος στήλης είναι κατάλληλος για την ανάλυση ουσιών σακχάρου. Ο συγγραφέας χρησιμοποίησε αυτόν τον τύπο στήλης όταν έκανε το περιεχόμενο και τις σχετικές ουσίες της ξυλόζης και των παραγώγων της. Τα ισομερή ενός παραγώγου ξυλόζης μπορούν επίσης να διαχωριστούν καλά.
3.3.2 Αμινο στήλη και κυανό στήλη Η αμινο στήλη και η κυανό στήλη αναφέρονται στην εισαγωγή τροποποιήσεων αμινο και κυανό στο τέλος της συνδεδεμένης αλκυλικής αλυσίδας, αντίστοιχα, για τη βελτίωση της επιλεκτικότητας για ειδικές ουσίες: για παράδειγμα, η στήλη αμινοξέος είναι μια καλή επιλογή για τον διαχωρισμό σακχάρων, αμινοξέων, βάσεων και αμιδίων. Η κυανό στήλη έχει καλύτερη επιλεκτικότητα όταν διαχωρίζει υδρογονωμένες και μη υδρογονωμένες δομικές παρόμοιες ουσίες λόγω της παρουσίας συζευγμένων δεσμών. Η άμινο στήλη και η κυανό στήλη μπορούν συχνά να εναλλάσσονται μεταξύ στήλης κανονικής φάσης και στήλης αντίστροφης φάσης, αλλά δεν συνιστάται η συχνή εναλλαγή. 3.4 Χειρική στήλη
Η χειρόμορφη στήλη, όπως υποδηλώνει το όνομα, είναι κατάλληλη για τον διαχωρισμό και την ανάλυση χειρόμορφων ενώσεων, ειδικά στον τομέα των φαρμακευτικών προϊόντων. Αυτός ο τύπος στήλης μπορεί να ληφθεί υπόψη όταν οι συμβατικές στήλες αντίστροφης φάσης και κανονικής φάσης δεν μπορούν να επιτύχουν το διαχωρισμό των ισομερών. Για παράδειγμα, ο συγγραφέας χρησιμοποίησε μια χειρόμορφη στήλη 5 μm*4,6 mm*250 mm για να διαχωρίσει τα δύο ισομερή της 1,2-διφαινυλαιθυλενοδιαμίνης: (1S, 2S)-1, 2-διφαινυλαιθυλενοδιαμίνη και (1R, 2R)-1, 2 -διφαινυλαιθυλενοδιαμίνη και ο διαχωρισμός μεταξύ των δύο έφτασε περίπου στο 2,0. Ωστόσο, οι χειρόμορφες στήλες είναι πιο ακριβές από άλλους τύπους στηλών, συνήθως 1W+/τεμάχιο. Εάν υπάρχει ανάγκη για τέτοιες στήλες, η μονάδα πρέπει να κάνει επαρκή προϋπολογισμό. 3.5 Στήλη ανταλλαγής ιόντων
Οι στήλες ανταλλαγής ιόντων είναι κατάλληλες για το διαχωρισμό και την ανάλυση φορτισμένων ιόντων, όπως ιόντων, πρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων και ορισμένων ουσιών σακχάρου. Ανάλογα με τον τύπο του πληρωτικού, χωρίζονται σε στήλες ανταλλαγής κατιόντων, στήλες ανταλλαγής ανιόντων και στήλες ανταλλαγής ισχυρών κατιόντων.
Οι στήλες ανταλλαγής κατιόντων περιλαμβάνουν στήλες με βάση το ασβέστιο και το υδρογόνο, οι οποίες είναι κυρίως κατάλληλες για την ανάλυση κατιονικών ουσιών όπως τα αμινοξέα. Για παράδειγμα, ο συγγραφέας χρησιμοποίησε στήλες με βάση το ασβέστιο όταν ανέλυσε το γλυκονικό ασβέστιο και το οξικό ασβέστιο σε ένα διάλυμα έκπλυσης. Και οι δύο ουσίες είχαν ισχυρές αποκρίσεις στα λ=210 nm και ο βαθμός διαχωρισμού έφτασε το 3,0. ο συγγραφέας χρησιμοποίησε στήλες με βάση το υδρογόνο κατά την ανάλυση ουσιών που σχετίζονται με τη γλυκόζη. Αρκετές κύριες σχετικές ουσίες – μαλτόζη, μαλτοτριόζη και φρουκτόζη – είχαν υψηλή ευαισθησία κάτω από διαφορικούς ανιχνευτές, με όριο ανίχνευσης τόσο χαμηλό όσο 0,5 ppm και βαθμό διαχωρισμού 2,0-2,5.
Οι στήλες ανταλλαγής ανιόντων είναι κυρίως κατάλληλες για την ανάλυση ανιονικών ουσιών όπως τα οργανικά οξέα και τα ιόντα αλογόνου. Οι ισχυρές στήλες ανταλλαγής κατιόντων έχουν υψηλότερη ικανότητα ανταλλαγής ιόντων και εκλεκτικότητα και είναι κατάλληλες για το διαχωρισμό και την ανάλυση σύνθετων δειγμάτων.
Τα παραπάνω είναι απλώς μια εισαγωγή στους τύπους και τις περιοχές εφαρμογής πολλών κοινών στηλών υγρής χρωματογραφίας σε συνδυασμό με την εμπειρία του συγγραφέα. Υπάρχουν άλλοι ειδικοί τύποι χρωματογραφικών στηλών σε πραγματικές εφαρμογές, όπως χρωματογραφικές στήλες μεγάλου πόρου, χρωματογραφικές στήλες μικρών πόρων, στήλες χρωματογραφίας συγγένειας, στήλες χρωματογραφίας πολλαπλών τρόπων, στήλες υγρής χρωματογραφίας εξαιρετικά υψηλής απόδοσης (UHPLC), υπερκρίσιμες στήλες υγρού (χρωματογραφία στήλης SFC), κλπ. Παίζουν σημαντικό ρόλο σε διαφορετικούς τομείς. Ο συγκεκριμένος τύπος χρωματογραφικής στήλης θα πρέπει να επιλέγεται σύμφωνα με τη δομή και τις ιδιότητες του δείγματος, τις απαιτήσεις διαχωρισμού και άλλους σκοπούς.
Ώρα δημοσίευσης: Ιουν-14-2024